Metal sensor slides: Ag, 10 pcs, On request

W SPR ligand to cząsteczka unieruchomiona na powierzchni sensora. Analit to cząsteczka w przepływie, a mierzona jest jej interakcja z unieruchomionym ligandem.

Immobilizacja to (zazwyczaj kowalencyjne) wiązanie cząsteczki do powierzchni czujnika. Można zastosować różne metody immobilizacji, na przykład wychwytywanie lub sprzęganie aminy, tiolu lub aldehydu. Sprzęganie aminy jest powszechnie stosowaną metodą, a cząsteczka, np. białko, jest wiązana kowalencyjnie do powierzchni sensora poprzez jej grupę aminową.

Immobilizacja obejmuje co najmniej trzy etapy: aktywację powierzchni, sprzęganie ligandu i dezaktywację powierzchni.

Efekt objętościowy to zjawisko występujące, gdy współczynnik załamania światła (RI) próbki różni się od RI buforu roboczego. Różnica RI jest zazwyczaj spowodowana dodatkami (np. pozostałościami rozpuszczalnika podstawowego) w próbce. Podczas wstrzykiwania próbki zmiana składu powoduje przesunięcie sygnału SPR i nazywa się to właśnie efektem objętościowym.

Przesunięcie objętościowe jest wyraźnie zauważalne w pomiarze i może zakłócać pomiar wiązania próbki, a występuje on równocześnie z wiązaniem. W eksperymentach z interakcjami molekularnymi efekt objętościowy jest zazwyczaj kompensowany poprzez zmniejszenie odpowiedzi kanału odniesienia (brak ligandu) od odpowiedzi kanału pomiaru (ligand). Pomiar kątowy MP-SPR umożliwia również unikalne wewnętrzne odniesienie dla efektu objętościowego. Funkcję tę nazywamy PureKinetics.

Regeneracja polega na usunięciu analitu z ligandu, dzięki czemu ligand pozostaje nienaruszony i aktywny na powierzchni.

Udana regeneracja umożliwia ponowne wykorzystanie powierzchni ligandu, i wiązanie innego analitu na tej samej powierzchni. Regeneracja jest wymagana w przypadku analitów, których dysocjacja przebiega powoli. Odpowiedni roztwór regeneracyjny zależy od cząsteczek wchodzących w interakcje i rodzaju interakcji. Zazwyczaj odpowiednie roztwory regeneracyjne należy określić empirycznie.

Najczęściej roztwory regeneracyjne to roztwory o niskim pH, takie jak 10 mM glicyny, lub roztwory o wysokim pH, takie jak 50 mM NaOH. Aktywność ligandu musi zostać potwierdzona po regeneracji, aby zapewnić wiarygodne wyniki.

Wybór odpowiedniego sensora karboksymetylodekstranu (CMD) zależy od wielkości cząsteczki analitu.

Jeśli analit jest związkiem o małej masie cząsteczkowej (np. lekiem o małej masie cząsteczkowej), ilość ligandu unieruchomionego na powierzchni powinna być większa, aby uzyskać wystarczający sygnał. W takim przypadku ligand powinien być unieruchomiony na powierzchni czujnika CMD 3D, aby uzyskać więcej miejsc wiązania analitu na powierzchni.

Jeśli analit jest większą cząsteczką (np. przeciwciałem), ligand powinien być unieruchomiony na powierzchni CMD 2D.

Dobrą zasadą jest, że jeśli analit ma masę mniejszą niż 20 kDa, należy użyć powierzchni 3D.

Zmiana bufora zmienia współczynnik załamania światła na powierzchni, co powoduje przesunięcie sygnału SPR.

Długie pomiary w otwartej kuwecie spowodują parowanie rozpuszczalnika, a tym samym wzrost jego stężenia, czemu należy zapobiegać. Zamknij otwarte kolby z buforem, a w przypadku długich eksperymentów przykryj płytki 96-dołkowe i fiolki z próbkami odpowiednimi pokrywkami.

Bardzo ważne jest, aby zawsze czyścić szklaną stronę przed włożeniem czujnika do instrumentu. Gdy komora przepływowa jest zamknięta, pryzmat jest ściśle połączony za pomocą elastomeru o dopasowanym indeksie ze szklaną stroną szkiełka czujnika. Jeśli szklana strona nie jest czysta, cząsteczki przylegają do elastomeru pryzmatu i zakłócają pomiary.

Szklaną stronę czyści się delikatnie, przecierając ją chusteczkami KimWipes (bezpyłowym papierem) zwilżonymi etanolem lub izopropanolem.

Złoty sensor można często całkowicie oczyścić metodą utleniania (stosując np. amoniak i H2O2), a sensor zazwyczaj nadaje się do wielokrotnego recyklingu.

Sensorów pokrytych hydrożelem nie można czyścić bez usunięcia powłoki dekstranowej.

Prawidłowa procedura czyszczenia zależy od powłoki sensora.

Typowe objętości próbek SPR we wszystkich eksperymentach interakcji biochemicznych wynoszą od 100 do 300 µl (do 500 µl w półautomatycznych modelach SPR Navi 200 i MP-SPR Navi 200 OTSO).

Należy pamiętać, że ilość próbki potrzebna na jedno wstrzyknięcie to w rzeczywistości stężenie x objętość!

Dostępna jest szeroka gama różnych powłok, odpowiednich zarówno do kowalencyjnego, jak i niekowalencyjnego sprzęgania białek.

Oferujemy funkcjonalizacje sensorów dla wszystkich powyższych metod.

MP-SPR dobrze współpracuje z lipidami w wielu formach. Zaletą jest możliwość sprawdzenia konformacji utworzonej warstwy przed rozpoczęciem iniekcji białka. Na podstawie grubości i współczynnika załamania światła można upewnić się, że film jest prawidłowo uformowany i że jest to w rzeczywistości warstwa dwuwarstwowa / liposomowa. W przypadku dwuwarstw lipidowych na nośniku zalecamy nasze sensory pokryte SiO₂. Do pracy z liposomami zalecany jest sensor CMD.

Pomiary MP-SPR przeprowadzono również na sensorach wiążących lipidy. Sensor posiada trójwymiarową powierzchnię hydrożelową i lipofilowe grupy kotwiczące, które wychwytują liposomy poprzez niespecyficzne interakcje. Inne metody to na przykład wykorzystanie biotynylowanych liposomów, białek z tagiem his osadzonych w liposomach lub fragmentów DNA w liposomach lub powierzchni krzemionkowych (które samoadsorbują liposomy).

Standardowym materiałem komory przepływowej jest PDMS i jest on kompatybilny, oprócz buforów wodnych, np. z glicerolem, glikolem etylenowym i DMSO (dimetylosulfotlenkiem).

Materiał komory przepływowej o wysokiej odporności chemicznej to PEEK i Kalrez, i mozna przy nich stosować znacznie szerszy zakres rozpuszczalników.

W urządzeniu MP-SPR Navi 200 OTSO standardowym materiałem rurek perystaltycznych jest również PDMS. Możliwe jest użycie zewnętrznej pompy strzykawkowej, jeśli wymagana jest praca z innymi rozpuszczalnikami organicznymi.

Pełną listę kompatybilnych rozpuszczalników i naczyń można znaleźć w załączniku do instrukcji obsługi urządzenia MP-SPR Navi.

Można przeprowadzać eksperymenty zarówno z białkami rozpuszczalnymi, membranowymi jak również białka wbudowane w pęcherzyki lipidowe.

Standardowa konfiguracja będzie działać z materiałami o RI w stanie stałym od n=1 do n=1,4, a nawet do 1,45 gdy stosuje się systemy o wielu długościach fali.

Jeśli wymagany jest jeszcze wyższy współczynnik RI (niektóre rozpuszczalniki organiczne), BioNavis oferuje oddzielną konfigurację o wysokim współczynniku RI. Wówczas współczynnik RI cieczy pomiarowej może wynosić do n=1,51.

Najczęstsze problemy z osadzaniem liposomów wynikają z czystości powierzchni i instrumentu lub ze zmiany rozmiaru liposomów.

Aby uzyskać powtarzalne tworzenie się dwuwarstwy lipidowej na sensorze SiO₂ SPR wymagane i kluczowe jest czyszczenie przed każdym osadzeniem lipidów. Skuteczny protokół czyszczenia polega na użyciu mieszaniny CHAPS-helmanex-etanol-woda przed każdym osadzeniem liposomów. Sensor należy używać bezpośrednio po oczyszczeniu przed osadzaniem.

Warstwy hydrofobowe mogą powodować tworzenie się lub zatrzymywanie powietrza w komorach przepływowych. Pęcherzyk powietrza uniemożliwi dobry kontakt cieczy z powierzchnią, co negatywnie wpłynie na jakość sygnału SPR.

W przypadku uwięzienia pęcherzyka powietrza na powierzchni, należy zapoznać się z instrukcją obsługi urządzenia, aby uzyskać instrukcje dotyczące jego usunięcia. Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków, należy ostrożnie odgazować bufory, i uważać podczas wstrzykiwania próbki, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza podczas wstrzykiwania.

Sprzęganie EDC/NHS zazwyczaj wiąże dużą ilość białek, ale wydajność konwersji wiązania jest wyższa niż 100%. Stabilizacja (wstrzyknięcia) po immobilizacji jest niezbędna do usunięcia niezwiązanego, zaadsorbowanego białka z warstwy, co może mieć negatywny wpływ na eksperyment w dalszej fazie analizy.

Czasami po iniekcjach regeneracyjnych, w przypadku stosowania czujnika CMD-3D, wymagany jest okres stabilizacji (kilka minut). Roztwory regeneracyjne zazwyczaj wykazują znaczną różnicę chemiczną w stosunku do buforu pomiarowego i mogą powodować pęcznienie/kurczenie się hydrożelu lub adsorpcję/desorpcję soli, co prowadzi do niewielkiego, ale systematycznego dryftu. W takim przypadku dodanie kilku dodatkowych minut do czasu linii bazowej między pomiarami jest dobrym pomysłem i pozwoli zaoszczędzić czas na późniejszym etapie analizy.

Zaleca się stosowanie wody dejonizowanej lub oczyszczonej do przygotowania buforów. Przefiltrowane ciecze, bufory i próbki pomagają zapobiegać przypadkowemu przyleganiu zawiesiny do powierzchni i wpływaniu na sygnał SPR. Odgazowanie roztworów również przyczyni się do uzyskania bardziej stabilnych wyników.

Oprogramowanie BioNavis LayerSolver to oprogramowanie przygotowane celowo do obliczania grubości i współczynnika załamania światła warstwy.

Typowa procedura oparta na pomiarze dwóch długości fal:
1) Pomiar oczyszczonej powierzchni próbki przy dwóch długościach fal jednocześnie
2) Pomiar osadzonej warstwy przy dwóch długościach fal
3) Analiza obu długości fal jednocześnie za pomocą LayerSolver
4) Wymagany jest dn/dlambda (przyrost długości fali RI) dla danego materiału lub podobnego typu materiałów.

Parametry początkowe dla sensorów złota BioNavis i długości fali 670 nm:

Minimalny kąt piku SPR można z grubsza przeliczyć tak, że 1 milistopień (mdeg) to 10 RU, czyli 1 ng/cm² przy długości fali 785 nm. Stała intensywność kąta zależy od powierzchni czujnika. Wartości te można przeliczyć na stężenie powierzchniowe białka (mole/cm² = ilość powierzchniowa), jeśli znana jest masa cząsteczkowa białek (używając wzoru: Ilość = Masa/Masa Molowa, n = m/M). Skalowanie pokrycia powierzchni można włączyć w „opcjach skalowania” zarówno w oprogramowaniu Viewer, jak i Control.

Należy pamiętać, że jest to przybliżenie (choć powszechnie akceptowane) i działa tylko w przypadku białek. Wynika to z faktu, że właściwości optyczne białek są w większości przypadków podobne. W przypadku bardziej egzotycznych próbek, aby uzyskać dokładne przeliczenie, konieczna jest znajomość (literatury lub pomiarów) zależności RI (masy) od stężenia (dn/dc).

Poniżej znajduje się pełne przeliczenie zmiany kąta piku SPR na stężenie powierzchniowe w molach. Należy pamiętać, że ze względu na uwzględnienie masy cząsteczkowej białek, wzór ten nie jest w rzeczywistości taki sam dla różnych białek, lecz nieznacznie różni się dla każdego z nich.

Ilość (mole/cm²) = (kąt SPR (stopnie)*1000*10^-9 (g/cm²/stopnie))/ masa cząsteczkowa białka (g/mol)

Można pozostawić urządzenie włączone przez cały czas, jeśli planujesz używać go codziennie.

Jeśli jednak nie musisz używać urządzenia codziennie, lepiej je wyłączyć, aby oszczędzać energię. Jeśli linia energetyczna nie jest wystarczająco stabilna lub od czasu do czasu występują przerwy w dostawie prądu, prosimy o dodanie do urządzenia zasilacza UPS (zasilacza awaryjnego).

MP-SPR Navi należy umieścić na stabilnym stole. Urządzenie jest bardzo wrażliwe na wstrząsy mechaniczne, dlatego nie należy narażać go na drgania, które mogłyby zakłócić pomiary. Należy wybrać miejsce, w którym urządzenie nie będzie narażone na działanie zewnętrznych źródeł ciepła lub chłodzenia, np. w bezpośrednim świetle słonecznym, w pobliżu otworów wentylacyjnych lub klimatyzatorów. Zewnętrzne ogrzewanie lub chłodzenie może powodować wahania temperatury i zakłócić pomiary.

Odpowiednie warunki do przechowywania systemów BioNavis:

Temperatura +15°C – +30°C, temperatura stabilna.
Wilgotność względna od 25% do 60%.
Niskie zapylenie, pomieszczenie klasy ISO-9 wg normy ISO-14644-1 (warunki „powietrza pokojowego” wg normy US FED STD 209E)
Stabilne i uziemione źródło zasilania (zalecane przez USP)
Trzymać z dala od bezpośredniego światła słonecznego
Trzymać z dala od źródeł zapłonu
Trzymać z dala od bezpośredniego przeciągów, takich jak wentylatory lub klimatyzatory

Maksymalny czas wstrzykiwania zależy od natężenia przepływu i objętości pętli.
Jeśli instrument zawiera pętle o pojemności 250 µl i natężenie przepływu wynosi 30 µl/min, maksymalny czas wstrzykiwania wynosi 7 minut.
Zaleca się wstrzykiwanie tylko 80% objętości pętli, gdy stężenie jest istotne dla pomiaru, ponieważ koniec próbki zostanie rozcieńczony (w zależności od modelu instrumentu). W modelach automatycznych wstrzykiwaną próbkę można zabezpieczyć przed rozcieńczeniem za pomocą segmentów powietrza. Zobacz animację i dowiedz się, jak działa zasada wstrzykiwania przepływowego tutaj.

Pamiętaj również, że nie musisz wstrzykiwać całej objętości pętli, można wykonywać krótsze iniekcje.

Po opróżnieniu próbki bufor przepłynie do kanału pomiarowego.

Standardowy rozmiar pętli to 250 µl, jednak pętlę można łatwo wymienić na mniejszą lub większą.

Modele urządzeń automatycznych (210A VASA, 220A NAALI i 420A ILVES) umożliwiają częściowe iniekcje pętli, co pozwala na wypełnienie pętli mniejszą ilością próbki niż wynosi jej całkowita objętość. Jest to bardzo przydatna funkcja, jeśli dostępna jest tylko niewielka ilość próbki i nie wymaga ona zmiany pętli.

Tak, BioNavis oferuje możliwość jednoczesnego pomiaru sygnałów SPR i fluorescencyjnych.

Dostępne są trzy opcje:

• fluorescencja sprzężona z powierzchniowymi plazmonami (opcja 1)
• fluorescencja z rozdzieleniem wiązki (opcja 2)
• fluorescencja wiązek włókien (opcja 3).

Urządzenie BioNavis jest elastyczne, a użytkownicy mogą je również modyfikować. Dlatego nie oznaczamy kanałów w portach wtryskowych.
W MP-SPR Navi 200 OTSO standardowe połączenie jest takie, że lewy port wtryskowy jest podłączony do górnego kanału, a prawy port wtryskowy do dolnego kanału przepływowego.

Istnieje jednak prosty sposób na sprawdzenie tego:
Gdy wszystkie przewody są suche, umieść złoty sensorw urządzeniu i rozpocznij pomiar kątowy. Napełnij jeden (!) z kanałów około 10% etanolem lub wodą, a drugą pętlę wtryskową pozostaw pustą (powietrze). Uruchom pompę (bez bufora, tylko powietrze) z zaworem wtryskowym ustawionym na „wtrysk”. Sprawdź, w którym kanale nastąpi zmiana sygnału. Wyjmij sensori sprawdź, który z kanałów jest zwilżony.

Gdy komora przepływowa jest zamknięta, pryzmat jest ściśle połączony za pomocą elastomeru o dopasowanym indeksie ze szklaną stroną suwaka sensora. Jeśli komora przepływowa jest zamknięta przez długi czas, elastomer może ulec uszkodzeniu. Uszkodzony elastomer zakłóciłby pomiary.

Można sprawdzić, czy elastomer jest w dobrym stanie, obserwując go gołym okiem pod kątem zarysowań, cząstek, zaschniętych soli lub testując go.

Umieść szklany czujnik (bez powłoki) w instrumencie i wykonaj pełne skanowanie kątowe. Krzywa powinna wzrosnąć do około 1 i pozostać płaska. Jeśli tak się nie dzieje, elastomer pryzmatu można przetrzeć izopropanolem (patrz instrukcja obsługi odpowiedniego instrumentu, rozdział „Rozwiązywanie problemów”) i skalibrować instrument. Jeśli kalibracja nie rozwiąże problemu, pryzmat będzie musiał zostać wymieniony.

Należy pamiętać, że rozdzielczość przestrzenna jest zazwyczaj podawana dla instrumentów wykorzystujących kamerę CCD jako komponent detekcji, takich jak obrazowanie SPR. Zazwyczaj instrumenty te są ograniczone rozdzielczością kamery i nie oferują tak dobrej czułości, jak instrumenty z wiązką skupioną lub MP-SPR.

W naszym przypadku zasada detekcji opiera się na prawdziwej konfiguracji goniometrycznej. Rzeczywista rozdzielczość kątowa goniometru wynosi 0,001 stopnia (najmniejszy krok goniometru), ale ponieważ do znajdowania minimum stosujemy zaawansowane algorytmy detekcji pików, minimalna pozycja SPR jest w rzeczywistości określana dokładniej niż krok goniometru.

Średnica „punktu” lasera na powierzchni płytki czujnika wynosi około 0,5 mm. Wyniki pomiarów MP-SPR są uśredniane dla tego obszaru (tj. grubość jest średnią dla obszaru 0,2 mm²).

Jeśli przez rozdzielczość przestrzenną rozumie się granicę detekcji instrumentu, to rozdzielczość zależy w znacznym stopniu od systemu pomiarowego i analitu. Ilość sygnału wytwarzanego przez analit można zwiększyć dzięki strukturze sensora (trójwymiarowe hydrożele zamiast dwuwymiarowych monowarstw), a w przypadku trójwymiarowych sensorów hydrożelowych szacunkowa dokładność bezpośredniego wykrywania analitów o małej masie cząsteczkowej jest rzędu nano-mikromoli (lub w przybliżeniu 300 fg/mm² – femtogramów na milimetr kwadratowy), ALE zależy to od samych interakcji.

Kluczowa różnica tkwi w układzie optycznym. Tradycyjny SPR wykorzystuje układ wiązki skupionej, który zapewnia zakres kątowy kilku stopni i mierzy tylko jeden parametr – minimum piku SPR, które jest następnie nanoszone na sensogram. Typowy zakres RI (współczynnika załamania światła) tradycyjnego SPR wynosi 1,3–1,4 (wskaźnika RI cieczy).

MP-SPR wykorzystuje konfigurację Kretschmanna i goniometryczny układ optyczny, co umożliwia skanowanie w zakresie 38 stopni i RI od 1,0 do 1,4. Oprócz pomiaru piku SPR, monitorowana jest pełna krzywa SPR i rejestrowane są inne parametry. Korelacja krzyżowa parametrów umożliwia unikalną funkcję PureKinetics. Pomiary długości fali z wykorzystaniem wielu laserów umożliwiają charakterystykę grubości warstwy i współczynnika załamania światła, co na przykład pozwala na wgląd w zmiany konformacji cząsteczek lub pęcznienie warstw.

Specjalna konfiguracja optyczna MP-SPR umożliwia znacznie szerszy zakres zastosowań w naukach przyrodniczych, rozwoju biosensorów i charakteryzacji materiałów. Dostępny jest też wyjątkowo szeroki wybór powierzchni sensorów, w tym Ag, Cu, Al2O3, SiO2, PET, PS, celuloza, CaP (fosforan wapnia). MP-SPR może mierzyć cienkie warstwy (np. pojedynczą monowarstwę grafenu 3,7 Å), a także grubsze warstwy (kilka mikrometrów, np. polielektrolity lub żywe komórki), a pomiary mogą być wykonywane nie tylko w fazie ciekłej, ale również w fazie gazowej.

Skanowanie kątowe jest zalecanym trybem pomiaru dla większości eksperymentów.

W tym trybie źródło światła skanuje w sposób ciągły w wybranym zakresie kątów, a pik SPR (wykres kąta w funkcji intensywności) może być monitorowany. Można śledzić kilka parametrów piku SPR w funkcji czasu (np. PureKinetics, minimalna pozycja piku, minimalna intensywność piku). Grubość i współczynnik załamania światła można obliczyć tylko na podstawie danych ze skanowania kątowego!

W trybie kątowym, kąt padania światła jest stały (źródło światła nie porusza się), a natężenie światła odbitego jest monitorowane w funkcji czasu. Pomiar kątowy pozwala na zwiększenie częstotliwości próbkowania – nawet do 250 punktów na sekundę (czas próbkowania 4 ms), ale zbiera mniej informacji o zmianach powierzchni. W trybie kątowym typowa częstotliwość próbkowania wynosi 2 sekundy.

W trybie kątowym można zatem zebrać więcej informacji z pomiaru w porównaniu z pomiarem kątowym, dlatego zdecydowanie zalecamy korzystanie z trybu skanowania kątowego.

Zakres temperatur wynosi +20/-7°C od temperatury otoczenia. To około 15-45°C w typowych warunkach laboratoryjnych.

Temperatura jest kontrolowana za pomocą elementu Peltiera. Obszar płytki dołkowej w modelach MP-SPR Navi 220A NAALI i 420A ILVES można schłodzić do +4°C.

Standardowy instrument jest wyposażony w laser 670 nm w każdym kanale przepływowym.

Standardowe instrumenty z dodatkowym zestawem laserów (opcja -L) są wyposażone w lasery 670 nm i 785 nm w każdym kanale.
Dwie długości fal na kanał przepływowy są niezbędne do określenia grubości i współczynnika załamania światła.
Wyższe długości fal charakteryzują się głębszą penetracją, większym zakresem dynamicznym, ale niższą czułością.

Możemy również dostarczyć inne długości fal – w zależności od dostępności. Do tej pory zainstalowaliśmy niestandardowe długości fal: 635, 650, 670, 785, 850 i 980 nm.

Możemy również dostarczyć niestandardowe wejście, umożliwiające użycie własnego źródła światła (w tym fluorescencji). Źródło światła musi być wyposażone w zewnętrzny wyzwalacz.